ELISA試驗中吸光值(OD值)普遍偏高可能由多種因素引起，以下是本生技術小編對常見原因及對應的解決方案：

　　一、常見原因及解決辦法

　　1. 抗體或抗原濃度過高

　　原因：捕獲抗體、檢測抗體或抗原濃度過高，導致信號過強。

　　解決：

　　優化抗體/抗原濃度，通過棋盤滴定法確定最佳稀釋比例。

　　重新評估標準曲線的濃度范圍。

　　2. 酶標抗體過量或孵育時間過長

　　原因：酶標抗體濃度過高或孵育時間過長，導致底物過度催化。

　　解決：

　　稀釋酶標抗體或縮短孵育時間(建議參考說明書并優化條件)。

　　嚴格按標準操作流程控制反應時間。

　　3. 底物反應時間過長

　　原因：底物(如TMB)顯色時間超出推薦范圍，導致顏色過深。

　　解決：

　　嚴格控制顯色時間(通常TMB為10-15分鐘)。

　　顯色后立即終止反應(加入終止液)，并在規定時間內讀數(如10分鐘內)。

　　4. 洗滌不充分

　　原因：未結合的抗體或酶標物殘留，增加背景信號。

　　解決：

　　增加洗滌次數(通常3-5次)。

　　確保每孔洗滌液充分填滿和排空，可使用自動洗板機優化程序。

　　5. 樣本或試劑污染

　　原因：樣本中存在干擾物質(如溶血、脂血)、試劑污染或交叉污染。

　　解決：

　　離心去除顆粒物，過濾或稀釋高脂樣本。

　　更換新試劑，避免試劑交叉污染。

　　6. 板孔干燥或密封不當

　　原因：孵育過程中板孔干燥，導致非特異性結合增加。

　　解決：

　　孵育時使用封板膜密封板孔，避免長時間暴露。

　　控制孵育濕度(如放置在濕盒中)。

　　7. 儀器或讀數錯誤

　　原因：酶標儀波長設置錯誤(如TMB應為450nm，校正波長630nm)或校準異常。

　　解決：

　　核對酶標儀波長是否正確，定期校準儀器。

　　確保板底清潔無劃痕，避免光學干擾。

　　8. 非特異性結合(高背景)

　　原因：封閉不充分或封閉蛋白與抗體交叉反應。

　　解決：

　　更換封閉劑(如使用BSA、脫脂奶粉或商業化封閉液)。

　　延長封閉時間(通常1-2小時)或提高封閉劑濃度(如5% BSA)。

　　9. 標準品或試劑失效

　　原因：標準品降解、底物溶液變質(如TMB暴露于光線下)。

　　解決：

　　檢查試劑有效期，避光保存底物。

　　重新配制標準品或更換新試劑。

　　二、系統性排查步驟

　　空白對照檢查：確認空白孔(僅底物+終止液)OD值是否正常(通常<0.1)。

　　梯度稀釋驗證：對樣本或標準品進行稀釋，觀察OD值變化是否符合預期。

　　重復實驗：更換新試劑/板條重復實驗，排除偶然誤差。

　　對照孔分析：檢查陰性對照是否正常，排除背景干擾。

　　三、預防措施

　　嚴格遵循試劑說明書操作，優化實驗條件。

　　定期校準儀器，確保環境溫濕度穩定。

　　記錄每次實驗細節(孵育時間、洗滌次數等)，便于追溯問題。

　　通過以上方法逐步排查，可有效解決OD值偏高的問題。若問題持續，建議聯系試劑廠家技術支持。

　　注：以上資料僅供參考，如需進一步了解產品詳情，可參考品牌供應商或技術老師。

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