一、核心原理：雙抗體夾心法

　　包被

　　實(shí)驗(yàn)開始前，96孔微孔板的孔內(nèi)壁已經(jīng)預(yù)先包被了一種高度特異性的捕獲抗體。這種抗體是針對(duì)大鼠胰島素受體β (ISR-β) 分子上的一個(gè)特定抗原表位的。

　　這些抗體牢固地吸附在塑料板表面，用于“捕獲"后續(xù)步驟中的目標(biāo)蛋白。

　　加樣與結(jié)合

　　將您的待測(cè)樣本(如大鼠的血清、血漿、細(xì)胞裂解液或組織勻漿)加入到微孔中。

　　如果樣本中含有大鼠ISR-β蛋白，它會(huì)被孔板上的捕獲抗體特異性地捕捉并固定住。

　　洗滌：洗去所有未被結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。

　　加檢測(cè)抗體

　　加入另一種檢測(cè)抗體。這種抗體同樣針對(duì)大鼠ISR-β分子，但識(shí)別的是另一個(gè)不同的抗原表位。

　　因此，它能與已被捕獲的ISR-β蛋白結(jié)合，形成 “捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體"的“三明治"復(fù)合物。

　　再次洗滌：洗去所有未結(jié)合的檢測(cè)抗體。

　　加酶標(biāo)記物

　　加入一種酶標(biāo)記的二抗(例如，辣根過(guò)氧化物酶-HRP標(biāo)記的鏈霉親和素-Streptavidin，如果檢測(cè)抗體是生物素-Biotin標(biāo)記的)。這個(gè)二抗會(huì)特異性地與檢測(cè)抗體結(jié)合。

　　此時(shí)，復(fù)合物變?yōu)?“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體-酶標(biāo)記二抗" 。

　　第三次洗滌：洗去所有未結(jié)合的酶標(biāo)記物。此時(shí)，孔中留下的酶量就與樣本中ISR-β的量直接相關(guān)。

　　加底物顯色

　　加入酶的無(wú)色底物(如TMB)。留在孔中的酶(如HRP)會(huì)催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成藍(lán)色的產(chǎn)物。

　　終止與測(cè)定

　　加入終止液(通常是稀硫酸)來(lái)終止酶促反應(yīng)。反應(yīng)液的顏色會(huì)由藍(lán)色變?yōu)榉€(wěn)定的黃色。

　　立即使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的光密度值(Optical Density, OD值)。

　　二、定量原理：標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　顏色的深淺(OD值的高低)與孔中結(jié)合的酶量成正比，而酶量又與樣本中ISR-β的含量成正比。

　　為了實(shí)現(xiàn)精確定量，試劑盒會(huì)提供一系列已知濃度的ISR-β標(biāo)準(zhǔn)品。將這些標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣本在同一塊板上同時(shí)進(jìn)行操作。

　　以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，以其對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)(Y軸)，繪制出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　最后，將待測(cè)樣本的OD值代入這條標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出樣本中大鼠ISR-β的精確濃度。

　　原理總結(jié)流程圖：

　　包被捕獲抗體 → 加入樣本(ISR-β被捕獲) → 洗滌 → 加入檢測(cè)抗體 → 洗滌 → 加入酶標(biāo)記二抗 → 洗滌 → 加入底物顯色 → 終止反應(yīng) → 測(cè)定OD值 → 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度

　　注：以上僅供參考，科研使用，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說(shuō)明或咨詢技術(shù)老師。

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